简介：旨在评估使用弹性体聚合物外部密封的实验性大直径血管移植物于绵羊降主动脉的插入移植物时的安全性和有效性。

  方法：将实验血管移植物和对照明胶密封介入移植物插入幼年羊的降主动脉。通过手术期间的止血时间和失血量以及不同时间点的血液学和生化小组对移植物做评估。术后3个月和6个月进行磁共振成像（MRI），然后对动物实施安乐死并进行尸检，包括移植物、吻合口和远端器官的宏观和显微镜检查。

  结果：所有动物均在研究期间存活。移植物的手术处理没有明显差异。实验组中位术中失血量为 27.5 mL（范围 10.0-125.0 mL），对照组为 50.0 mL（范围 10.0-75.0 mL）。实验组的中位止血时间为 5.0 分钟（范围 2.0-16.0 分钟），而对照组为 6.0 分钟（范围 4.0-6.0 分钟）。MRI 显示两组血流正常且移植物通畅。两组的愈合和吻合口周围内皮化相似。

  结论：与常用的人工血管移植物相比，实验性移植物具有相似的安全性和性能，尸检结果也基本相当，与纳入内膜周围的对照移植物相比，实验性移植物的主要不同之处在于外部纤维囊的非粘附性。研究组与对照组的存活率、止血密封性、血液学和放射学结果相当。

  人工血管移植物经常用来医治心血管疾病，例如动脉瘤或闭塞、先天性畸形，或在终末期肾病的情况下提供外周血管通路。尽管不常见，但并发症仍然会发生，并且发病率很高，甚至死亡率很高。因此，寻求更好且容易获得的合成替代品仍然具有现实意义。在不一样的人工血管移植物中，涤纶移植物自 20 世纪 50 年代起就开始使用，为心血管外科医生提供了一种用途极其广泛且具有非常出色长期耐用性的材料。第一代移植物需要预凝固，以防止在植入过程中通过移植物间隙渗漏。用胶原蛋白、弹性蛋白或白蛋白密封大口径编织和针织血管移植物的管腔表面，消除了这一步骤，减少了失血，并使移植物能用来紧急手术和完全肝素化的情况。

  目前，可用的密封产品是动物源性的。虽然移植物涂层通常在术后 1 至 2 周内吸收，但涂层移植物似乎与术后全身炎症反应有关。然而，临床影响通常是有限的，并且超过了与未涂层移植物相关的缺点。在极少数情况下，愈合不充分或移植物渗出可能会引起血清肿形成，从而可能会引起胸腔积液或腹腔积液。用合成惰性聚合物代替动物源密封剂有可能减少血管移植物的炎症反应并进一步改善组织愈合和融合。

  此外，除了消除这一些副产品风险外，动物产品替代品还具有改善供应和生产控制的优势，因为目前使用的化合物来自于少量不含牛海绵状脑病的牛群资源。最后，它还为患者提供了避开使用动物产品制作植入物的选择。

  RUA 血管移植物被设计为目前使用的涂有动物源性密封剂的人工血管移植物的替代品。RUA 血管移植物是一种编织聚酯移植物，外部用 Elast-Eon 共聚物密封。优选外部密封以在管腔侧提供多孔表面以用于细胞附着，同时仍然防止通过外部移植物壁渗出。Elast-Eon 聚合物由羟基封端的聚二甲基硅氧烷和亚甲基二苯基二异氰酸酯基聚氨酯的共聚物形成。所得化合物具有聚氨酯良好的机械强度，聚氨酯是一类适合长期植入式医疗器械的材料。硅成分的存在为Elast-Eon聚合物提供了更高的柔韧性、生物稳定性和生物相容性，结合了聚氨酯和有机硅的优点，Elast-Eon聚合物具有独特性，因此大范围的使用在植入式医疗器械的涂层。

  在这项非劣效性研究中，我们假设 Elast-Eon 聚合物在 RUA 血管移植物中的应用与常用的人工血管移植物相比具有相似的安全性和性能特征，从而提供了动物源性产品的替代品。

  所有动物均由兽医根据美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》进行护理。当地伦理委员会独立于研究申办者批准了该研究。

  RUA 血管移植物是一种直的大口径（直径 18 毫米）聚酯编织卷曲移植物，外部采用 Elast Eon（一种生物稳定聚合物）密封，已获得 RUA Life Sciences plc 的许可（图 1）。植入的对照移植物是相同尺寸的Gelweave直移植物。两种移植物均由相同的聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯组成。

  图 1 RUA 血管移植物的管腔、未涂层（顶部）和外部、涂层（底部）表面的放大视图。

  从 KU Leuven 的 TRANS 农场获得 15 只雌性幼羊（Lovenaar 品种），年龄在 1 至 2 岁之间，体重 60-70 kg，在 Medanex 诊所的动物设施中进行手术前隔离。本探索性研究未进行样本量计算。中心兽医通过临床检查发现有怀孕、感染或疾病迹象的动物被排除在外。雄性动物被排除在外，因为处理雄性绵羊不太安全，并避免在研究期间雌性绵羊可能怀孕。手术后，动物在该设施中观察和护理 6 个月。

  这些动物是在一位训练有素、执业的心血管外科医生的监督下进行的，这位外科医生在主动脉手术方面拥有超过 15 年的经验，并得到了几名心脏外科住院医师的协助。术前使用10-20mg/kg体重肌肉注射后，在全身麻醉下进行手术。用1%-5%的氧气溶液诱导并维持麻醉。气管插管后开始机械通气。调整所有通气参数以使动脉血气和 pH 值保持在生理范围内。放置大口径口胃管以防止瘤胃膨胀。连接并监测心电图肢体导联。开始维持林格氏溶液静脉滴注。静脉注射庆大霉素（6.6 mg/kg，Genta-Kel 10%）和苄青霉素钠（40,000 U/kg，青霉素，1,000,000单位）。将动物以右侧卧位放置在手术台上。通过第四肋间隙进行左侧胸廓切开术，并进行颈部切开术以暴露颈总动脉。给予肝素（200 IU/kg）后，在左颈总动脉和远端降主动脉之间插入被动分流器，以便在主动脉钳夹期间实现远端灌注。没有给予其他药物。手术过程中活化凝血时间保持在400秒以上。主动脉的近端和远端被夹住，并移除一小段以允许植入5厘米的插入移植物。使用 5/0 聚丙烯缝线植入移植物。记录术中止血的时间，即从移除十字夹到止血的时间，以及用于帮助止血的任何措施，例如胶水或额外缝合线。当血流动力学参数稳定后，移除分流器。胸部分层封闭，左侧胸膜腔设有胸腔引流管。

  一旦动物出现自主呼吸、潮气量充足且血流动力学稳定，就立即脱离呼吸机。拔管前拔除胸腔引流管。术后立即仔仔细细地观察动物长达 7 天。此后，动物返回受控动物设施，每天检查羊的总体健康情况并获得后续数据。术后未给予药物治疗。

  术后12周和24周，给动物注射镇静剂以进行MRI检查。动物预先用（肌注10-20mg/kg体重）给药，插管并用1%-2%维持麻醉。动物在 3T MRI 设备上屏气期间以右侧卧位进行扫描。在移植位置的降主动脉的横向和纵向平面上获取高分辨率电影图像。获得了对比增强主动脉图（3D 血管序列）以及 3D Dixon 序列以及水和脂肪分离图像。移植物的 3D 网格是根据阈值分割 3D MR 血管序列而获得的。确定了近端和远端吻合，并重建了移植物近端和远端约 1 cm 的部分。在这些近端和远端主动脉部位、以及近端和远端吻合处以及移植物的中部确定横截面。计算每个横截面的平均直径。移植物的长度被测量为两个吻合的质心之间的距离。

  在手术前、植入当天、90.2（±6）天和178（±4）天时采集连续血样。获得每只羊的标准化全血细胞计数以及 LDH、血浆中游离血红蛋白和触珠蛋白以评估溶血，并获得 CK、肌酸酐和尿素以评估肾功能。

  动物在 6 个月时被安乐死。如前所述，对它们进行准备和麻醉。MRI评估后，羊静脉注射肝素（3mg/kg），并通过静脉注射过量的Euthasol溶液实施安乐死。将移植物与两个吻合部位一起移出并用盐水冲洗。将移植物纵向打开以进行内部检查并对移植物的流入和流出方面做拍照。移植物的检查包括检查密封剂分层、血栓形成、内皮化、内膜增生、通畅、炎症或感染及结构完整性。取出肝脏、脾脏和肾脏，并将活检组织保存在 4% 缓冲中，用于进一步的肉眼观察和组织学检查。

  对于组织学，从吻合口和移植物中部区域制备 5 毫米厚的横截面。将切片包埋在石蜡中。所有切片均用苏木精和伊红 (HE) 染色。在我们实验室优化绵羊组织的染色方案后，选择的切片用市售抗体 CD11b（Abcam 的 ab133357）、CD3（Abcam 的 ab5690）、Vimentin（Dako 的 m0725）和 vWF（Abcam 的 ab6994）抗体进行染色。病理学家使用光学显微镜评估组织的组织学完整性、组织中是不是真的存在炎症反应以及愈合过程的程度。

  使用正态概率图或 ShapiroeWilk 检验对所有数据来进行正态性测试。血液学和生物化学数据及 MRI 多个方面数据显示正态分布，证明使用参数检验并将值报告为平均值和标准差。由于围手术期失血量的测量结果不呈正态分布，因此使用非参数检验并将值表示为中位数。使用标准 t 检验比较平均值，使用 ManneWhitney-U 检验比较中位数。

  12 只动物被分配到研究组，并植入 18 毫米 RUA 血管移植物，三只动物被分配到对照组，植入市售 18 毫米 Gelweave 血管移植物。

  没有动物因手术干预、麻醉或随访期间死亡。通过兽医的按时进行检查评估，这些动物仍处于健康状态。因此，没有数据被排除在研究之外。

  使用标准缝合技术植入移植物，所有吻合均采用聚丙烯 5/0 缝合线 项需要额外的吻合缝合以确保止血。外科医生报告了类似的处理和缝合特征，在实验移植物的手术植入中未曾发现异常困难。缝合孔没有明显出血，研究或对照移植物都不需要胶水或密封剂。外科医生报告称，仅拉伸特性存在一定的差异，与对照移植物相比，RUA 血管移植物的纵向长度在手动张力下延伸较少。在估计正确的种植体长度时必须考虑到这一点。没有对处理进行系统调查。

  在手术前、植入当天、90.2（±6）天和178（±4）天时采集连续血样。考虑到动物数量有限，RUA血管移植物和对照移植物在全血细胞计数、溶血参数或肾功能方面没有重大差异。血液检测和统计分析的结果可在补充材料中找到。

  术中失血量中位数（通过吸引受者中收集的体积来测量），RUA 血管移植物为 27.5 mL（范围 10.0-125.0 mL），对照移植物为 50.0 mL（范围 10.0-75.0 mL）（P 1/4） 0.945）。RUA 血管移植物异常值包括一只动物因主动脉插管部位出血而术中失血 125.0 mL，另一只动物因主动脉侧支出血而术中失血 100.0 mL。RUA 血管移植物的中位止血时间（由停止移植物和吻合渗出所需的时间定义）为 5.0 分钟（范围 2.0-16.0 分钟），而对照移植物为 6.0 分钟（范围 4.0-6.0 分钟） （P=0.839）。12 个 RUA 血管移植组中有 8 个没有胸腔引流管引流，术后中位失血量为 0.0 mL（范围 0.0-20.0 mL）。所有三只对照动物都有一些胸腔引流，平均失血量为 10.0 mL（范围 10.0-15.0 mL，P =0.101）

  在 3 个月间隔时，MRI 成像显示 RUA 血管移植物的移植物长度为 45.0 ±3.3 mm，移植物直径为 18.95 ±1.2 mm，这与凝胶编织对照移植物没有不同，在这种情况下，移植物 长度为 46.0 ±2.6 mm，移植物直径为 17.7 ±0.6 mm。这些尺寸在 6 个月间隔内保持稳定，此时 RUA 血管移植物显示移植物长度为 45.4 ±3.3 mm，移植物直径为 19.0 ± 0.8 毫米，对于 Gelweave 对照移植物，移植物长度为 45.3 ±2.9 毫米，移植物直径为 17.7 ±0.7 毫米。这些发现表明，所有植入的移植物都保持了其结构，没有证据说明在 3 个月或 6 个月的时间间隔内有扩张（图 2）。此外，据报告，所有 RUA 血管移植物均保留了移植物的通畅性和性能，没有闭塞或假性动脉瘤形成，所有植入物的血流特征均正常。在 12 只接受 RUA 血管移植的动物中，有 4 只发现移植物周围有少量聚集，而 12 只动物中有 3 只有大量聚集。在 6 个月的 MRI 扫描中，七只动物中的五只完全消除了这些集合，而其余两只则减少了。三分之二的对照动物显示出小的管腔内肿块，其中一只在 3 个月时有相关的移植物周围聚集，而肿块在 6 个月时尺寸增大。

  图 2 MRI，右侧为 6 个月时胸降主动脉 RUA 血管移植物（顶部）和 Gelweave 对照移植物（底部）的 3D 重建，表明两种移植物类型的结构均得到保留。

  尸检时，所有动物均未发现外周器官（肝、脾、肾）近期出现血栓栓塞性损伤；没有观察到宏观的特殊性。没有观察到植入的移植物的扩张或感染。所有吻合口均显示正常愈合，无血肿或夹层形成。所有 RUA 血管移植物的吻合处形成移植物周围组织。然而，当远离吻合口向移植物的中心部分移动时，移植物周围组织不再粘附于移植物，导致移植物与中心部分的周围组织之间形成清晰的解剖平面。12 只动物中有 5 只的移植物周围空间含有血栓（图 3）。除了偶尔出现的血栓外，所有病例中均不存在别的多余的移植物周围液体，因此未对血清液做多元化的分析。所有对照移植物的移植物周围组织与移植物均牢固粘附，但三分之二的对照动物具有红色管腔内肿块（图4）。组织学证实两组周围器官均未出现血栓栓塞性损伤。在吻合处，RUA 血管移植物显示管腔以及近端和远端吻合处的外侧存在成熟且有组织的结缔组织。吻合口的腔侧被一层内皮覆盖。CD11b 染色显示，管腔侧移植物纤维周围有一些多核巨细胞（图 5）。在移植物的外侧，有组织的结缔组织并沉积有含铁血黄素色素。在移植物的中心部分，管腔侧仅显示出间歇性的纤维蛋白覆盖。外侧的反应包括由间质细胞和胶原蛋白组成的移植物周围组织形成，如波形蛋白染色所示（图 6）。该移植物周围组织不粘附于移植物，但表现出与吻合处相同的特征，并且其内表面上还存在覆盖纤维蛋白。没有观察到聚合物覆盖层分层。肉眼观察到的移植物周围血栓由纤维蛋白和红细胞组成，它们部分组织并融入移植物周围的结缔组织中（图7和7之二）。如 CD3 染色所示，除了管腔侧与移植纤维相邻的多核巨细胞外，不存在可提及的炎症成分（图 8）。

  对照移植物显示出相似的组织学特征，吻合口两侧再次存在成熟且有组织的结缔组织。如 vWF 染色所示，吻合口的腔侧被一层内皮覆盖（图 9）。移植物的外侧有组织化的结缔组织，仅有少量含铁血黄素色素沉积。与 RUA 移植物不同，对照移植物的中心部分确实显示出粘附的移植物周围组织，在移植物的管腔和外侧均存在多核巨细胞。宏观观察到的管腔内肿块由附着在移植物管腔表面的组织血栓材料组成。这种血栓的成分各不相同，在吻合口附近它被组织成结缔组织，而在中心它仍然由与白细胞混合的纤维蛋白组成（图10）。

  图 4 Gelweave 移植物显示广泛的内皮覆盖以及腔内肿块形成和附着在移植物上的外囊

  图 5 两个移植物周围存在巨噬细胞和多核巨细胞（箭头所示）。请注意，在 RUA（顶部）移植物的情况下，巨细胞仅存在于腔侧，这表明移植物的外侧与移植物周围组织之间没有物理接触。在 Gelweave（底部）移植物的情况下，移植物纤维的两侧明显存在巨细胞。正如在此重塑背景下所预期的那样，其他巨噬细胞以分散的方式存在。使用市售的抗CD11b抗体进行染色。

  图 6 RUA（上图）和 Gelweave（下图）移植物周围形成的纤维组织中的间质细胞，用市售的抗波形蛋白抗体染色。请注意，由于波形蛋白不是特异性标记物，因此它所染色的细胞比单独的纺锤形间质细胞（箭头所示）要多。

  图 7 朝向绵羊 0736 移植物中心部分的远端吻合术（绿色箭头所示）的 HE 切片的显微图像 (x1.25)，显示源自组织化纤维蛋白的组织化结缔组织覆盖管腔侧 (L) 层。从吻合处开始管腔表面发生内皮化。在外侧，存在源自移植物周围组织 (P) 的移植物周围血肿（红色箭头所示），部分组织成结缔组织，如下面的 x10 图像所示（图 7bis）。注意移植物周围组织与移植物缺乏附着。图 7bis 图 4 的详细图像 (x10) 血栓 (A) 由纤维蛋白和红细胞组成，并逐渐融入移植物周围的结缔组织 (B)。

  图 8 RUA（上）和 Gelweave（下）移植物两侧的 T 淋巴细胞（箭头所示），T 淋巴细胞参与反应过程，如本实验中移植物周围的重塑。正如预期的那样，它们以分散的方式存在，并用市售的抗 CD3 抗体在其膜上染色。

  图 9 RUA（顶部）和 Gelweave（底部）移植物的内皮过度生长的图示。内皮细胞是一层厚的扁平细胞，覆盖管腔移植物表面，并用市售的抗 vWF 抗体进行强烈染色（箭头所示）。

  图 10 Gelweave 对照移植物的中心部分，管腔侧 (L) 覆盖有组织结缔组织（蓝色箭头），源自组织血栓（红色箭头）。移植物周围组织 (P) 牢固地附着在移植物的纤维上。

  图 11 RUA（顶部）和 Gelweave（底部）移植物周围形成的纤维组织的放大视图。两种情况下的移植物周围组织均由具有梭形间质细胞的结缔组织组成，并与重塑巨噬细胞和淋巴细胞混合，如前面的图所示。实验组之间的主要不同之处在于，对于 RUA 移植物，移植物周围的纤维不附着在移植物材料上，并且不存在多核巨细胞。在 Gelweave 移植物的情况下，移植物周围组织 (*) 附着在移植物材料上并包含多核巨细胞，说明组织合并和异物反应仅发生在 Gelweave 对照移植物的情况下。

  常用的大口径血管移植物采用动物源性密封剂密封，以防止术中移植物出血。由于动物源性产品在生物相容性、可用性、成本等方面存在困难，因此人们有兴趣开发这种密封剂的合成替代品。RUA 血管移植物采用 Elast-Eon 共聚物进行外部密封，作为一种可能的合成替代品，以提供不渗透性。这种独特的聚合物经过了广泛的离体性能测试，并在之前的动物研究中作为载药表面、机械心脏瓣膜或起搏器引线的在允许电压下不导电的材料的应用中显示出改善的长期生物稳定性。在这项研究之前，RUA 也已对应用于血管移植的 Elast-Eon 进行并通过了 ISO10993 生物相容性测试。使用 Elast-Eon 聚合物的应用已植入人体超过 15 年，主要作为植入设备的铅绝缘。虽然大范围的应用于各种人体应用，关于这些化合物临床表现的证据非常有限，因此本研究等更多研究的重要性不言而喻。

  先前已提出血管移植物的聚合物涂层，尽管 Elast-Eon 拥有非常良好的生物稳定性、机械性能和低血栓形成性，但与某些共混弹性体相比，它的细胞附着性相对较差且纤维化增加。然而，技术进步现在仅允许在外表明上进行涂层，从而保留腔内血液暴露于多孔聚酯编织物。正如 Rahlf 和同事在 1986 年指出的那样，在移植物开发的早期，多孔性对血管移植物很重要。特别是，缺乏孔隙度会导致内囊脱离，因此导致栓塞。这一现象也有报道。具有内包裹的移植物表现出这种并发症。此外，已确定外部屏障不一定会影响来自吻合口的组织向内生长或多能细胞从外部的循环沉积。

  包裹的和完全多孔的移植物具有基本相同的管腔表面。本研究选择绵羊模型，因为它是评估此类移植物的临床前安全性和有效性的既定模型。羊的价格实惠，而且相对容易长期饲养。绵羊的体细胞生长速度低于小牛，这减少了潜在的体型不匹配。与人体组织反应的一个重要区别是预期更高的内皮化率，因为血管移植物是在健康的幼年羊身上来测试的，但最终将在老年人的患病血管中发挥其最大的作用。与人类相比，绵羊的相对高凝性是另一个需要仔细考虑的差异，尽管绵羊的凝血系统比狗或猪更接近人类。在本研究中，出于实际原因，仅使用雌性绵羊。考虑到绵羊止血和血管愈合特性的性别差异，可用数据有限。一项研究表明，雄性绵羊的活化部分凝血活酶凝血时间（aPTT）值明显高于雌性绵羊，而两性之间的凝血酶原时间（PT）值没有显着差异。据我们所知，该领域尚未进行其他研究。

  RUA 血管移植物的组织学评估显示出与 Gelweave 对照移植物相似的特征。组织反应符合预期，并且与详细描述的所有植入物的一般愈合过程一致。在这两种情况下，吻合通常处于经吻合内皮化的愈合过程的成熟阶段。Gelweave 对照移植物的中心部分在管腔内被血栓材料覆盖，该血栓材料主要由纤维蛋白组成，并逐渐分化为结缔组织。由于明胶密封剂是专门针对其促血栓形成作用而设计的，因此预计在 RUA 血管移植物中会看到较小程度的这种反应。纤维蛋白反应和内皮化程度与 Zilla 及其同事对人类的描述完全相同。大口径聚酯移植物已植入人体超过 50 年，尽管管腔表面基本上没有内皮，但它们的长期临床性能很出色。两种移植物之间的主要不同之处在于移植物周围组织的水平 （图11）。在凝胶编织对照移植物的情况下，移植物周围组织粘附到外部移植物表面，移植物纤维的两侧都存在多核巨细胞，强调粘附。然而，RUA 移植物并未附着在移植物周围组织上。由于在移植物周围组织的内表面上没看到多核巨细胞，因此移植物周围组织和移植物之间没有粘附。如前所述，Elast-Eon 聚合物位于移植物的外侧，这是预料之中的现象。在某一些程度上，移植物周围组织的内表面在所有情况下都被纤维蛋白覆盖，并且在某些情况下甚至覆盖有已经部分并入移植物周围结缔组织中的血栓。此外，移植物周围组织显示出出血灶和富含含铁血黄素的巨噬细胞。这可能表明两个组件之间的摩擦可能是纤维蛋白或血栓覆盖移植物周围内表面的原因，这一发现与之前起搏器导线的组织学研究一致。

  所有类型的移植物都有几率发生术后假体周围积液。虽然早期发生的症状通常不需要治疗即可消退，但在某些情况下，移植物周围血清肿可能持续存在，并表明移植物渗漏、过度炎症或移植物融合不良。令人欣慰的是，使用 RUA 血管移植物观察到的早期集合在 6 个月时已经消退或正在消退。未曾发现液体积聚持续不断的增加的证据，这表明存在有效的渗漏屏障。由于组织学上没有观察到过度炎症，因此不能排除我们实验中观察到的移植物周围聚集与观察到的外部纤维囊不粘附之间有关联。

  RUA 血管移植物在所有动物中均拥有非常良好的耐受性，Elast-Eon 对移植物进行了良好的止血密封。手术处理特征、血液学和放射学结果与 Gelweave 对照移植物相似。尸检结果主要具有可比性，RUA 血管移植物与 Gelweave 移植物相比，主要不同之处在于 Gelweave 移植物与内膜周围结合良好，而 RUA 血管移植物的外部纤维囊不粘连。

  这项研究有三个主要局限性。首先，我们的数据基于大量实验动物（n = 12），但仅基于有限的对照动物（n = 3）。尽管如此，我们在对照组中的发现与文献中描述的结果一致，因此我们大家都认为比较是有效的。其次，血管移植物常常要在体内发挥数十年的功能，而我们的实验是在 6 个月时评估结果。然而，我们始终相信，考虑到组织学结果，这项研究提供了有关早期愈合反应形态的重要信息。最后，个人会使用绵羊模型来研究实验移植物的安全性和性能。选择与绵羊一起工作是基于文献资料而谨慎做出的。动物模型对于外科领域的新颖性（例如这种实验性移植物）的临床前体内测试至关重要；然而，它们仍然只是一个模型。将我们的结果转化为临床情况时应考虑到这一点。

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